جداسازی و شناسایی مولکولی قارچ های سلولولیتیک مولد cbh1 از جنگل های شمال ایران و بررسی فعالیت سلولازی آن ها

سلولز اصلی ترین ترکیب موجود در توده ی زیستی گیاهان و فراوان ترین مولکول زمین می باشد. تخریب سلولز با مخلوطی از آنزیم های تجزیه کننده ی سلولز شامل اندوگلوکانازها، اگزوگلوکانازها و بتاگلوکوزیدازها انجام می شود که سلولاز نامیده می شوند. طیف وسیعی از میکروارگانیسم ها، از قبیل باکتری ها و قارچ ها می توانند سلولز و سایر فیبرهای موجود در دیواره سلولی گیاهان راتخریب کنند. با این که قارچ ها نقش کلیدی در تخریب بقایای گیاهان در اکوسیستم های خاکی بازی می کنند ولی اغلب آن ها ناشناس باقی مانده اند. این تنوع میکروبی کشف نشده می تواند منبع عظیمی از آنزیم های جدید سلولازی باشد. بنابراین هدف این مطالعه، جداسازی قارچ های سلولازی خاک جنگل های بابل واقع در شمال ایران و بررسی وجود ژن cbh1 به عنوان مهم ترین ژن سلولازی در آن ها می-باشد. برای شناسایی طیف وسیع تری از ژن های سلولازی و قارچ های مولد آن ها، علاوه بر روش سنتی کشت، استخراج مستقیم dna از خاک جهت جداسازی محتوی ژنتیکی قارچ های غیر قابل کشت استفاده شد. نمونه ی خاک در محیط اختصاصی که تنها منبع کربن آن سلولز می باشد کشت شده و در سه دمای 20، 25 و ?c30 گرماگذاری شد. نتایج الکتروفورز بر روی ژل آگارز نشان داد که علی رغم این که روش مستقل از کشت در رسیدن به dna ژنومی کارآمد بوده و آزمون pcr با پرایمرهای دژنره باندهای مجزایی را حاصل داد، ولی باندهای استخراج شده از ژل الگوی مناسبی برای عمل توالی یابی نبودند. این مشکل عمدتاً ناشی از عدم خلوص باندهای dna استخراج شده از ژل می باشد که نشان دهنده لزوم انجام عمل همسانه سازی dna قبل از توالی یابی می-باشد. نتیجه ی روش کشت سوسپانسیون خاک نیز جداسازی 40 جدایه قارچی با خاصیت سلولازی بود که پس از غربال گری کیفی جدایه ها با روش قرمز کنگو، 7 جدایه با فعالیت سلولازی بیشتر انتخاب شده و cdf2، cdf20، cdf13، cdf26، cdf4، cdf5 و cdf19 نامگذاری شدند. فعالیت اندوگلوکانازی، اگزوگلوکانازی و fpase این جدایه ها به صورت کمی بررسی و باtrichoderma reesei ptcc 5142 مقایسه شدند. نتایج به دست آمده نشان داد که جدایه تریکودرمایی cdf13 با میزان فعالیت اندوگلوکانازی 552/1 (u/ml)، اگزوگلوکانازی 2040/0 (u/ml) و فعالیت کلی 3430/0 (u/ml) فعال ترین جدایه در بین تمامی جدایه ها سلولز اصلی ترین ترکیب موجود در توده ی زیستی گیاهان و فراوان ترین مولکول زمین می باشد. تخریب سلولز با مخلوطی از آنزیم های تجزیه کننده ی سلولز شامل اندوگلوکانازها، اگزوگلوکانازها و بتاگلوکوزیدازها انجام می شود که سلولاز نامیده می شوند. طیف وسیعی از میکروارگانیسم ها، از قبیل باکتری ها و قارچ ها می توانند سلولز و سایر فیبرهای موجود در دیواره سلولی گیاهان راتخریب کنند. با این که قارچ ها نقش کلیدی در تخریب بقایای گیاهان در اکوسیستم های خاکی بازی می کنند ولی اغلب آن ها ناشناس باقی مانده اند. این تنوع میکروبی کشف نشده می تواند منبع عظیمی از آنزیم های جدید سلولازی باشد. بنابراین هدف این مطالعه، جداسازی قارچ های سلولازی خاک جنگل های بابل واقع در شمال ایران و بررسی وجود ژن cbh1 به عنوان مهم ترین ژن سلولازی در آن ها می-باشد. برای شناسایی طیف وسیع تری از ژن های سلولازی و قارچ های مولد آن ها، علاوه بر روش سنتی کشت، استخراج مستقیم dna از خاک جهت جداسازی محتوی ژنتیکی قارچ های غیر قابل کشت استفاده شد. نمونه ی خاک در محیط اختصاصی که تنها منبع کربن آن سلولز می باشد کشت شده و در سه دمای 20، 25 و ?c30 گرماگذاری شد. نتایج الکتروفورز بر روی ژل آگارز نشان داد که علی رغم این که روش مستقل از کشت در رسیدن به dna ژنومی کارآمد بوده و آزمون pcr با پرایمرهای دژنره باندهای مجزایی را حاصل داد، ولی باندهای استخراج شده از ژل الگوی مناسبی برای عمل توالی یابی نبودند. این مشکل عمدتاً ناشی از عدم خلوص باندهای dna استخراج شده از ژل می باشد که نشان دهنده لزوم انجام عمل همسانه سازی dna قبل از توالی یابی می-باشد. نتیجه ی روش کشت سوسپانسیون خاک نیز جداسازی 40 جدایه قارچی با خاصیت سلولازی بود که پس از غربال گری کیفی جدایه ها با روش قرمز کنگو، 7 جدایه با فعالیت سلولازی بیشتر انتخاب شده و cdf2، cdf20، cdf13، cdf26، cdf4، cdf5 و cdf19 نامگذاری شدند. فعالیت اندوگلوکانازی، اگزوگلوکانازی و fpase این جدایه ها به صورت کمی بررسی و باtrichoderma reesei ptcc 5142 مقایسه شدند. نتایج به دست آمده نشان داد که جدایه تریکودرمایی cdf13 با میزان فعالیت اندوگلوکانازی 552/1 (u/ml)، اگزوگلوکانازی 2040/0 (u/ml) و فعالیت کلی 3430/0 (u/ml) فعال ترین جدایه در بین تمامی جدایه ها سلولز اصلی ترین ترکیب موجود در توده ی زیستی گیاهان و فراوان ترین مولکول زمین می باشد. تخریب سلولز با مخلوطی از آنزیم های تجزیه کننده ی سلولز شامل اندوگلوکانازها، اگزوگلوکانازها و بتاگلوکوزیدازها انجام می شود که سلولاز نامیده می شوند. طیف وسیعی از میکروارگانیسم ها، از قبیل باکتری ها و قارچ ها می توانند سلولز و سایر فیبرهای موجود در دیواره سلولی گیاهان راتخریب کنند. با این که قارچ ها نقش کلیدی در تخریب بقایای گیاهان در اکوسیستم های خاکی بازی می کنند ولی اغلب آن ها ناشناس باقی مانده اند. این تنوع میکروبی کشف نشده می تواند منبع عظیمی از آنزیم های جدید سلولازی باشد. بنابراین هدف این مطالعه، جداسازی قارچ های سلولازی خاک جنگل های بابل واقع در شمال ایران و بررسی وجود ژن cbh1 به عنوان مهم ترین ژن سلولازی در آن ها می-باشد. برای شناسایی طیف وسیع تری از ژن های سلولازی و قارچ های مولد آن ها، علاوه بر روش سنتی کشت، استخراج مستقیم dna از خاک جهت جداسازی محتوی ژنتیکی قارچ های غیر قابل کشت استفاده شد. نمونه ی خاک در محیط اختصاصی که تنها منبع کربن آن سلولز می باشد کشت شده و در سه دمای 20، 25 و ?c30 گرماگذاری شد. نتایج الکتروفورز بر روی ژل آگارز نشان داد که علی رغم این که روش مستقل از کشت در رسیدن به dna ژنومی کارآمد بوده و آزمون pcr با پرایمرهای دژنره باندهای مجزایی را حاصل داد، ولی باندهای استخراج شده از ژل الگوی مناسبی برای عمل توالی یابی نبودند. این مشکل عمدتاً ناشی از عدم خلوص باندهای dna استخراج شده از ژل می باشد که نشان دهنده لزوم انجام عمل همسانه سازی dna قبل از توالی یابی می-باشد. نتیجه ی روش کشت سوسپانسیون خاک نیز جداسازی 40 جدایه قارچی با خاصیت سلولازی بود که پس از غربال گری کیفی جدایه ها با روش قرمز کنگو، 7 جدایه با فعالیت سلولازی بیشتر انتخاب شده و cdf2، cdf20، cdf13، cdf26، cdf4، cdf5 و cdf19 نامگذاری شدند. فعالیت اندوگلوکانازی، اگزوگلوکانازی و fpase این جدایه ها به صورت کمی بررسی و باtrichoderma reesei ptcc 5142 مقایسه شدند. نتایج به دست آمده نشان داد که جدایه تریکودرمایی cdf13 با میزان فعالیت اندوگلوکانازی 552/1 (u/ml)، اگزوگلوکانازی 2040/0 (u/ml) و فعالیت کلی 3430/0 (u/ml) فعال ترین جدایه در بین تمامی جدایه ها بوده و cdf5 با فعالیت اندوگلوکانازی 6135/0 (u/ml)، اگزوگلوکانازی 1024/0 (u/ml) و فعالیت کلی 1575/0 (u/ml) به عنوان فعال ترین جدایه غیرتریکودرمایی می باشد. آنالیز مولکولی این دو نمونه نشان داد که جدایه cdf5 با میزان تشابه 99% بیشترین نزدیکی را با coriolopsis gallica داشته و جدایه cdf13 با 100% تشابه احتمالا ًtrichoderma pseudokoningii می باشد